RSS

Gen Transferi

| Etiketler: ,


     GEN TRANSFER YÖNTEMLERİ
            
Gen tedavisinde, etkin bir gen aktarımı en önemli bir koşuldur. Genleri istenilen hücrelere taşıyabilmek için kullanılan yöntemler genel olarak iki kategoride toplanmaktadır: Fiziksel yöntemler ve biyolojik vektörler. 

 
    Fiziksel yöntemler, DNA'nın doğrudan doğruya enjeksiyonu, lipozom formülasyonları ve balistik gen enjeksiyonu yöntemlerini içerir. Doğrudan DNA enjeksiyonunda ilgili gen DNA'sını taşıyan plazmit, doğrudan doğruya, örneğin kas içine, enjekte edilir. Yöntem basit olmasına karşın kısıtlı bir uygulama alanı vardır.Lipozomlar, lipidlerden oluşan moleküllerdir. DNA'yı içlerine alma mekanizmalarına göre iki guruba ayrılırlar: Katyonik lipozomlar ve pH-duyarlı lipozomlar. Birinci gurup lipozomlar artı yüklü olduklarından, eksi yüklü olan DNA ile dayanıklı bir kompleks oluştururlar. İkinci gurup lipozomlarsa negatif yüklü olduklarından DNA ile bir kompleks oluşturmaz, ama içlerinde taşırlar. Parça bombardımanı ya da gen tabancası olarak da adlandırılan balistik DNA enjeksiyonu, ilk olarak bitkilere gen nakli yapmak amacıyla geliştirilmiştir. Bu ilk uygulamalarından sonra, bazı değişiklikler yapılarak memeli hücrelerine gen nakli amacıyla kullanılmaya başlanmıştır. Bu yöntemde, genellikle altın ya da tungstenden oluşan 1-3 mm boyutunda mikroparçacıklar, tedavi edici geni taşıyan plazmit DNA'sı ile kaplanır, sonra da bu parçacıklara hız kazandırılarak, hücre zarını delip, içeri girmeleri sağlanır. Basit olmalarına karşın fiziksel yöntemler verimsizdir; ayrıca, yabancı genler, sadece belirli bir süre fonksiyonal kalabilmektedirler. Bu nedenle araştırmacıların çoğu, genellikle virüs kökenli vektörlere yönelmişlerdir. "Vektör" kelimesinin bir anlamı da "taşıyıcı"dır. Benzer şekilde, gen terapisinde genleri hücrelere taşıma amacıyla kullanılan ve genetik olarak zararsız hale getirilmiş virüslere de vektör denir.
        Günümüzde yapılan araştırmalarda, virüslerin hastalığa yol açan gen parçalarının yerine, hastaları iyileştirme amacıyla rekombinant genler yerleştirilmektedir. Bu amaçla değiştirilmiş hücreler kullanılmaktadır. Bu hücrelere tedavi edici geni taşıyan bir genetik yapı sokulduğunda, tedavi edici geni içinde taşıyan virüsler elde edilir. Bu şekilde değiştirilmiş virüsler hücreye girmek için kendi yöntemlerini kullanırlar ve genomlarının ekspresyonu sonucu, genin kodladığı protein üretilmeye başlanır. Öte yandan, virüsün kendisini çoğaltmak için ihtiyaç duyduğu genler, tedavi edici genlerle değiştirilmiş olduğundan, virüs çoğalıp hücreyi patlatamaz. Bunu yerine, hücrede virüsün taşıdığı hastalığı düzeltici genin ekspresyonu olur, genin kodladığı protein (yani ilaç) üretilir ve genetik bozukluk nedeniyle üretilemeyen proteinin yerini alır.
En çok kullanılan viral vektörler, retrovirüsler, adenovirüsler, herpesvirüsler (uçuk virüsü) ve adeno-ilişkili virüslerdir. Ama her vektörün kendine özgü dezavantajları vardır: Bölünmeyen hücreleri enfekte edememek (retrovirüs), olumsuz immünolojik etkiler (adenovirüs), sitotoksik etkiler (herpesvirüs) ve kısıtlı yabancı genetik materyal taşıyabilme kapasitesi (adeno-ilişkili virüs). İdeal bir vektörde aranan özellikler yüksek titraj, kolay tasarlanabilme, integre olabilme yeteneği ve gen transkripsiyonunun kontrol edilebiliyor olmasının yanında, imünolojik etkilerin olmamasıdır.
                                   Gen Aktarim Teknikleri
Viral Vektorler:                                
1. Retroviral vektörler                    
2. Adenoviral vektörler                 
3. Adeno-asociated virus                 
4. Herpes Simpleks Virus Tip-1         
5. Polio Virus                                 
6. Ördek Hepatit Virusu                 
7. Parvovirus                                
8. Sendaivirus                             
9. Sindbis virus
                                Fiziksel ve Kimyasal Yöntemler
1. Transferin-reseptörü aracılığı ile    
2. Asiaglikoprotein DNA konjugatları
3. Lipofection                                 
4. Direk aktarım
5. Kalsium fosfat çöktürmesi ile       
6. Diethilaminoetil dekstran
7. Elektroporasyon                         
8. Sonikasyon
9. Kazıma yöntemiyle                    
10. Polibrene/dimetilsulfoksid
11. Jet injeksiyon                           
12. Partikül bombardımanı
                    Genlerin vücuda yerleştirilmesi yöntemleri
Genleri vücuda yerleştirmenin çeşitli yolları vardır. Genel olarak, gen tedavisi iki esas bölümde sınıflandırılabilir.
1. ex vivo yaklaşım: Bu yaklaşımda hücreler vücuttan alınır; in vitro kosullarda gen transferi yapılır. Tekrar vücuda geri verilir. Bu yaklaşımın avantajları şunlardır:
a. Gen aktarımı genel olarak yüksektir.
b. Eger vektör seçilebilir marker gen taşıyorsa; gen aktarılan hücreler  zenginleştirilebilir.
c. Re-implantasyon öncesinde etkinlik kontrol edilebilir.
2. in vivo yaklaşım: Vücuttaki hücrelere genlerin direk transferidir. Bu aktarım, in vitro koşullarda gerçekleştirilir ve hücreler alıcıya tekrar geri verilerek yapıldığı gibi alıcının dokusuna in situ direk aktarım şeklinde de yapılabılır. Ayrıca henüz kullanılmamakta ise de bir vektör aracılığı ile de kan yoluyla aktarım gerçekleştirilebilir. Bu vektörler plasmidin konakçı hücrede takibini sağlayacak şekilde flöresans ile işaretlenebilir. En önemli sorun spesifiklik ve durağan gen transferinin düşük etkinliğidir. Bu klinikde arka arkaya tedavi işlemlerini gerektirmektedir. Gen tedavisinde antisens oligonükleotid kullanımı Antisens oligonükleotidler, küçük sentetik nükleotid dizileri olup; bunlar spesifik DNA veya RNA dizilerine komplementerdirler. Eksojen oligonükleotidler  nükleik asit bağlayıcı reseptörler aracılığı ile hücre içerisine alınırlar. Terapötik ürün olarak hazırlanmalarında başlıca sorun hücre içerisine taşınabilmeleridir. Oligonükleotidlerin gen tedavisinde kullanılması ‘eğer belirli bir gen bir hastalıktan sorumlu ise; bunun çalıştırılmaması klinik anormalliğin düzelmesini sağlayabilir’ prensibinden yola çıkarak tasarlanmaya başlanmıştır. Antisens oligonükleotidler genin çevrilmesini durdurarak hastalığa neden olan genlerin ekspresyonunu engelleyen yapılardır. Bu yapılar onkogenleri kontrol altına alabilmekte ve virüs DNA’sının çevrilmesini engelleyebilmektedirler.
      Bir çok ilaçda amaç defektif veya istenmeyen proteinin sentez edildikten sonra fonksionuna engel olmaktır. Antisens teknolojide amaç protein sentezinin spesifik kısa tek sarmal DNA veya RNA dizileri kullanılarak önlenmesidir. Bu önleme, protein sentezinin:
1) Genomik DNA'nın mRNA'ya transkripsiyonunda
2) mRNA'nın proteine translasyonu sırasında mümkün olabilir.
Sitoplazmik mRNA, DNA 'ya oranla daha kolay bir hedef gibi görünmektedir. In vitro çalışmalarda, anormal mRNA oluşturan Burkitt lenfoma hücre dizilerinin çoğalması antisens oligonükleotidlerle durdurulmuştur. Antisens oligonükleotidler, hücre dizilerinin kanserleşmesini veya metastatik potansiyellerini azaltır. Anti-sens olarak geliştirilen ve AIDS'li hastalarda oluşan sitomegalovirus retinitini tedavi edecek olan ilaç intra vitreal enjeksiyonla 1998 yılında insanda kullanılmaya başlanmıştır.
Oligonukleotid ile gen fonksiyonu 
Amaç DNA'da var olan hatanın, yapısal DNA hatasına dönüştürülerek, tamir mekanizmasının tanıyabilmesini sağlamaktır. 20 bazlık bir oligonükleotide bağlanan bir alkile edici ajan, ikili helikse yapışır. Tek iplikçikli oligonükleotid hedef DNA'da kendisine uyan bölgeye yapışır. Replikasyon sırasında, hücre tamir mekanizmaları devreye girer ve düzeltmeyi yapar.
Bu metod ile obesite, b-adrenerjik reseptör mutasyonu, Hb S ve kistik fibrozisin gen tedavisi çalışmaları yapılmaktadır.
    Değişik doku ve hücrelerde gen tedavi yaklaşımları aşağıda özetlenmiştir.
Kemik iligi: Kemik iliği transplantasyonu için gerekli olan teknik işlemlerin ve tedavinin geliştirilmesi ile hematopoetik sistem gen tedavisi için uygun bir aday doku olmuştur. Pluripotent hematopoetik kök hücre, kemik iliği hücrelerinin %0.01-0.1'i kadardır. Pluripotent olması ve kendiliğinden yenilenmesi, ideal bir hedef doku halini almasını sağlar. Ex vivo tedavinin en güzel örneğidir. Bir kaç hücreye bir gen aktarımı olması halinde dahi, aktarılan genin sürekli varlığı mümkün olacaktır. Yüksek sınıf hayvanlarda, bu hücrelerin enfekte edilmesi güçtür. Kemik iliğindeki bağ dokusu hücrelerinin etkin transferde önemli rolü olduğu gösterilmiştir. Kemik iliğinin gen tedavisi için ilk hedef doku olmasının nedenleri şöyle sıralanabilir.
1- Kemik iliği hücreleri kolayca elde edilebilir.
2- In vitro olarak çalışılabilirler.
3- Bireye tekrar reinfüze edilebilirler.
4- Infüzyon sonrası organizmada çoğalarak, farklılaşmaya uğrarlar. Böylece organizmada yeni bir hücre popülasyonu oluşturulabilir.
Kas: Çok sayıda hedef hücreye gereksinim olduğundan; yüksek etkinlikte gen transferine ihtiyaç vardır. Retrovirusla infekte edilen primer myoblastların hayvan kası içine zerk edilmesi ile altı aylık bir sürenin üzerinde gen ekspresyonu sağlanmıştır. En önemli dezavantajı, myoblastların zerk edildigi bölgede kalmasıdır. Adenovirus vektörünün intravenöz olarak sıçana verildikten sonra, etkin bir transduction hem kas fibrillerinde, hem de diğer dokularda sağlanmıştır. Kas fibrillerinin in vivo direkt gen aktarım teknikleri için de kullanılabildiği gösterilmiştir. Plazmid DNA'nın iskelet ve kalp kaslarına direkt zerki ile durağan gen ekspresyonu sağlanmıştır. Bu zerk edilen plazmid DNA'sı hücrede episomlar olarak bulunmaktadır. Bu prosedür, primatlarda çok etkin değildir.Insan büyüme hormonu genlerinin transferi ile de hayvanlarda bu hormonun düzeyleri üç ay sonra belirlenebilmiştir.
Karaciğer: Hepatositleri, kültür ortamında manüple etmek oldukça güçtür. Çünkü bu hücreler kültür ortamında çok az bölünmeye uğrarlar ve retroviral vektörlerle transduction etkinliği %20-25 gibi düşük düzeylerdedir. Her ne kadar in vivo olarak, hepatositler normal koşullarda bölünmezken, kısmi hepatektomi, hepatositlerin hücre bölünmesini aktive eder. Bunu takiben retrovirus vektörünün in vivo perfüzyonu ile çok sayıda hepatosit infekte edilebilir. Ancak etkinlik %1-2 civarındadır. Alfa-1- antitrypsin geni intraportal yolla adenoviral vektörle karaciğere aktarılmışsa da, genin ekspresyonu kısa sürmüştür.
Santral sinir sistemi: Yapısal ve fizyolojik kompleksliği nedeni ile SSS bozukluklarında somatik gen tedavisi uygulanması beraberinde önemli sorunları da getirmektedir. HSV-1 vektörleri hem in vivo, hem de ex vivo olarak sinir hücrelerinde aktarımda kullanılmıştır.
Trakea epiteli: Bu hücrelerin organizma dışına alınıp, kültüre edilmesi ve sonra tekrar organizmaya implante edilmesindeki zorluklar nedeni ile in vivo aktarım kullanılmaktadır. Adenoviral vektörler ile trakea epiteline invivo gen aktarımı, sıçanlarda başarılmıştır.
Lenfosit: Adenosine Deaminaz enzim eksikliğinde kullanılmıştır. T hücrelerinin yaşam sürelerinin sınırlı olmasının nedeni ile arka arkaya infüzyona ihtiyaç bulunmaktadır. AIDS ve kanser tedavisinde en uygun hedef doku olarak ortaya çıkmaktadır.
Oküler hücreler: Vitröz içine adenovirus aracılığı ile gen aktarımı yapılmıştır.
Periferik kan progenitör hücreler: Kemik iliği yerine, periferik kandan izole edilen progenitör hücrelere gen transfer edilmesi ile uzun süreli hematopoesis saglanmıştır.

www.tips-fb.com

0 yorum:

Yorum Gönder

Kaydol: Kayıt Yorumları (Atom)